兵庫県の高砂町（今の高砂市）で、漢方医美濃部秀芳の次男として生まれた。地元の高砂小学校や小野中学校で学び、勉強がよくできた。のちに東京の第一高等中学校へ進み、法律と政治の学問の道を歩むことになる。
帝国大学法科大学の政治学科に入学し、のちに天皇機関説をとなえる憲法学者一木喜徳郎に教えを受けた。一木の考え方は、美濃部の学問の土台となった。1897年に卒業すると、高等試験に合格して内務省の役人となった。
法律の制度の歴史を比べて研究するため、ドイツ・フランス・イギリスへの留学を命じられた。留学中に東京帝国大学の助教授となり、1902年に帰国すると教授となった。ドイツの国法学から、のちの学説につながる考え方を学んだ。
師の一木夫妻の仲立ちで、文部大臣菊池大麓の三女民子と結婚した。この年、法学博士となり、東京高等商業学校（今の一橋大学）でも憲法と行政法を教えた。のちに行政法の講座も受け持ち、憲法と行政法の両方で第一人者となった。
著書『憲法講話』で天皇機関説を示した。国家を一つの法人と考え、天皇はその最高の機関として憲法にしたがって国を治める、という学説である。天皇が絶対の主権をもつと説く上杉慎吉と激しく論争し、学界の主流となっていった。
憲法の講座も受け持つようになり、本やノートを一切見ずに講義を続けた。教え子の清宮四郎は、その姿を「人間わざとは思えない」と語っている。宮沢俊義ら多くの弟子を育て、その学説は議会を重んじる政党政治を理論の面で支えた。
ロンドン海軍軍縮条約をめぐり、軍の一部が統帥権の干犯だと政府を攻めると、兵力の量を決めるのは内閣の責任だと述べ、浜口雄幸内閣を支持した。軍の力が強まる時代のなかで、憲法にもとづく政治を守ろうとした。
天皇から選ばれる勅選の貴族院議員となった。この年に起きた血盟団事件で井上準之助が命を落とすと、政府の右翼への取りしまりが甘いと批判した。1934年には東京帝国大学を退官し、名誉教授となった。
貴族院で菊池武夫が天皇機関説を激しく非難し、軍部や右翼による攻撃が広がった。美濃部は「一身上の弁明」の演説で学説の正しさを筋道立てて説いたが、著書は発売を禁じられ、貴族院議員を辞めることになった。
自宅をたずねてきた右翼の男に襲われ、けがを負った。犯人は身分をいつわって訪ねてきたのだった。学説を理由に命まで狙われるほど、言論の自由がせばめられていく時代であった。美濃部はその後も静かに研究を続けた。
戦後、内閣の憲法問題調査会の顧問や枢密顧問官として、憲法改正の議論にかかわった。今の憲法のもとでも民主化はできると考え、枢密院での新しい憲法案の採決でただ一人反対した。そのため古い自由主義者の限界とも言われた。
日本国憲法ができると、その研究も熱心に進め、多くの本や論文を書いた。前の年には法政大学の通信教育部の初代部長となった。新しい憲法が施行されて約1年後の5月に亡くなった。弟子の宮沢俊義らが、戦後の憲法学を受けついだ。
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