尾張国（愛知県）で、丹羽長政の子として生まれた。丹羽氏はもともと尾張の守護斯波氏に仕える家だった。尾張では織田家の中で争いが続いており、若い長秀はやがて織田信長に仕える道を選ぶことになる。
このころから織田信長に仕え、尾張統一の戦いに加わった。のちに信長の兄・信広の娘を信長の養女として妻に迎え、信長の一族に近い立場となった。信長は長秀を深く信頼し、「友であり兄弟」とまで書いた手紙もあると伝わる。
信長が足利義昭を立てて京へ上るとき、近江の六角氏の箕作城を攻め落とす戦いで活躍した。信長の天下取りの大きな一歩となったこの上洛で、長秀は戦の先頭に立つ有力な家臣の一人として名を知られるようになった。
浅井氏の家臣が守っていた近江の佐和山城が降伏すると、長秀はその城を任された。佐和山は京と岐阜を結ぶ道の要所で、浅井・朝倉氏との戦いの最前線だった。長秀は戦だけでなく、城と領地を治める力でも信長の期待に応えた。
朝倉氏がほろびたあと、長秀は若狭（福井県南部）一国を与えられ、織田家の家臣の中で最初に一国を任された一人となった。家臣団の間では「木綿藤吉、米五郎左」と、なくてはならない米のような存在とたとえられたと伝わる。
信長が近江に安土城を築くとき、長秀は工事の総責任者（総奉行）を任された。高い石垣と天主をもつ新しい城の建設を何年もかけて進め、1579年に天主が完成した。安土城は天下人の城として、その後の城づくりの手本となった。
信長が京都で天皇の前で大規模な馬ぞろえ（軍事パレード）を行ったとき、長秀は一番目に入場する名誉を与えられた。織田家の重臣の中でも、長秀がとくに重んじられていたことを示す出来事とされる。
四国へ渡る準備のため信長の三男・信孝とともに大坂にいたとき、本能寺の変が起きた。兵の多くが逃げてしまい、すぐには動けなかったが、中国地方から急ぎ戻った羽柴秀吉と合流し、山崎の戦いで明智光秀を破るのに加わった。
信長亡きあとの織田家の跡継ぎと領地を決める清洲会議に、柴田勝家・羽柴秀吉・池田恒興とともに出席した。長秀は秀吉の意見を支え、信長の孫の三法師（のちの秀信）が跡継ぎに決まった。この選択が、秀吉の台頭を後押しすることになった。
秀吉と柴田勝家が争った賤ヶ岳の戦いで、長秀は秀吉に味方して勝利を助けた。戦いのあと、勝家の領地だった越前と加賀の一部を与えられ、北ノ庄城に入った。領地は約120万石ともいわれ（諸説あり）、豊臣政権の重臣となった。
北ノ庄城で病のため亡くなった。重い胃の病だったと伝わり、最期のようすには諸説ある。長秀の死後、子の長重は領地を大きく減らされたが、のちに江戸時代には大名として家を立て直した。信長と秀吉の両方を支えた、信頼の厚い武将だった。
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教科書や伝記で確かめられる事実をもとにしています。不確かなことは「諸説あり」「と伝わる」としています。