播磨国（兵庫県）赤穂藩の家老・大石良昭の長男として生まれた。大石家は代々赤穂藩浅野家の重臣をつとめる家で、生まれたときから藩を支える家老となることが期待されていた。幼名は松之丞と伝わる。
父の良昭が若くして亡くなり、祖父の良欽に引き取られて育てられた。少年時代には、そのころ赤穂に流されていた兵学者・山鹿素行に学んだとも伝わるが、はっきりしたことは分かっていない。のちに京都の伊藤仁斎に学んだともいわれる。
祖父の良欽が亡くなり、大石家の家督を継いだ。まもなく赤穂藩の筆頭家老となり、藩主の浅野長矩を支える立場についた。ふだんの内蔵助はおだやかで目立たず、「昼行灯（ひるあんどん）」とあだ名されたと伝わる。
但馬国豊岡藩の家老をつとめる石束家の娘りく（理玖）と結婚した。二人のあいだにはのちに三男二女が生まれた。家老として藩の政治を担いながら、家庭を築いていった時期で、まだこのとき大石家に大きな試練が待っているとは誰も思っていなかった。
長男の松之丞（のちの大石主税良金）が生まれた。主税はのちに父とともに赤穂浪士の一人として行動し、浪士の中で最も若い一人となる。内蔵助にとって、家の跡継ぎとなる大切な息子だった。
備中松山藩の水谷家が跡継ぎがなく取りつぶされると、内蔵助は幕府の命で浅野家が受け取りを任された備中松山城へ向かい、城の明け渡しを無事に済ませて、しばらく城を預かった。この経験は、のちに自らの赤穂城を明け渡すときに生かされたともいわれる。
藩主の浅野長矩が江戸城の松の廊下で、高家の吉良義央に斬りかかる事件を起こした。長矩はその日のうちに切腹を命じられ、赤穂藩は取りつぶされた。吉良にはおとがめがなく、知らせを受けた赤穂の家臣たちは激しく動揺した。
城にこもって戦うべきだという意見も出る中、内蔵助は家臣たちの意見をまとめ、赤穂城を幕府に無事に明け渡した。そして浅野家を立て直すため、長矩の弟の浅野大学による家の再興を幕府に願い出た。城を出たあとは京都の山科に移り住んだ。
内蔵助は妻のりくと離縁して実家へ帰し、家族に罪が及ばないようにした。この年の夏、浅野大学が広島の本家へ預けられることが決まり、家の再興の望みは絶たれた。内蔵助は京都の円山で同志と話し合い、吉良を討つことを決めた。
元禄15年12月14日の夜明け前、内蔵助ら47人の浪士が江戸本所の吉良邸に討ち入り、吉良義央を討ち取って主君のかたきを討った。浪士たちは主君の墓がある高輪の泉岳寺へ向かい、主君の墓前に討ち入りをなしとげたことを報告したと伝わる。
浪士たちは大名の屋敷に分けて預けられ、内蔵助は熊本藩細川家の屋敷で手厚く扱われた。幕府では処分をめぐって議論が分かれたが、切腹が命じられ、内蔵助は武士として静かに生涯を閉じた。泉岳寺の主君のそばに葬られ、その物語はのちに「仮名手本忠臣蔵」となった。
新井白石尾形光琳柳沢吉保荻原重秀市川團十郎（初代）徳川家宣荻生徂徠雨森芳洲
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